کشت بافت گیاه فیلودندرون

گیاه فیلودندرون

فیلودندرون دومین جنس بزرگ خانواده Araceae است که ۴۸۰ گونه منحصراً نئوتروپیک دارد. تنوع مورفولوژیکی که در بین گونه‌های مختلف، ارقام اخیراً توسعه‌یافته و عادت رشد آنها وجود دارد، ارقام فیلودندرون را برای استفاده به‌عنوان گیاهان زینتی رومیزی، سبدهای آویز، توتم یا گیاهان کف مناسب می‌سازد.

کشت بافت گیاه فیلودندرون

کشت آزمایشگاهی یک روش تولید مثل غیرجنسی در شرایط آسپتیک است که از توانایی هر سلول گیاهی برای تولید افراد ژنتیکی یکسان استفاده می کند. تولید گیاهان زینتی از این تکنیک برای تکثیر گیاهان با درجه یکنواختی و سلامت بالایی استفاده کرده است. اکثر گیاهان تجاری از جنس فیلودندرون با کشت بافت آزمایشگاهی تکثیر می شوند.
برای شروع کشت های آزمایشگاهی، یک مشکل جدی با آلاینده ها وجود دارد، زیرا آنها به طور سودمندی با گیاهان برای مواد مغذی در محیط کشت رقابت می کنند و در نهایت بافت ها را می کشند. بنابراین، توسعه پروتکل‌های کارآمد ضدعفونی ریزنمونه‌ای که میکروارگانیسم‌های خارجی را از بین می‌برد، ضروری است.
از این نظر، تیمار گیاهان مادر با قارچ‌کش‌ها و باکتری‌کش‌ها قبل از استقرار در شرایط آزمایشگاهی و در طی فرآیند ضدعفونی ریزنمونه‌های فیلودندرون در دستیابی به آسپسیس مؤثر است، زیرا از عوامل بیماری‌زای میزبان در اندام‌های گیاه پیشگیری و از بین می‌رود.
کشت آسپتیک سه رقم فیلودندرون را با سمپاشی گیاهان مادری با Ridomil MZ® و Mancozeb® یک هفته قبل از جداسازی ریزنمونه ایجاد کرد و آنها را با اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه ضد عفونی کرد و سپس محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد (v/v) را ضد عفونی کرد. 20 دقیقه استقرار آسپتیک Aglaonema sp را به دست آورد. با خیساندن ریزنمونه ها در آنتراکول به مدت 30 دقیقه، سپس در اتانول 70 درصد به مدت دو دقیقه و در نهایت در 20 و 50 درصد کلروکس® به مدت ده دقیقه.
اخیراً کاربرد نانوذرات نقره (AgNPs) در کشت بافت گیاهی به دلیل توانایی آنها در از بین بردن میکروارگانیسم‌های مؤثر بر کشت‌های آزمایشگاهی افزایش یافته است. پروتکل‌های ضدعفونی ریزنمونه در طی استقرار آزمایشگاهی با AgNPs نتایج آسپتیک خوبی را ایجاد می‌کنند.
با توجه به اهمیت اقتصادی فیلودندرون و نیاز به مواد ریزازدیادی کافی برای تولیدکنندگان این گیاه، هدف از این تحقیق ایجاد پروتکلی برای استقرار کشت آسپتیک در شرایط آزمایشگاهی فیلودندرون xanadu برای شروع تکثیر انبوه و پاسخگویی به تقاضا این گونه بود. 

درمان گیاهان مادر با مواد ضدعفونی کننده

نهال‌های فیلودندرون به ارتفاع 8 سانتی‌متر، به‌دست‌آمده از کشت آزمایشگاهی و سازگاری، در گلدان‌های 6 اینچی حاوی تزونتل (سنگ آذرین قرمز با منشاء آتشفشانی) با اندازه ذرات 5 میلی‌متر به عنوان بستر مستقر شدند. پس از نشاء، گیاهان با محصولات ضدعفونی کننده اسپری شدند. گیاهان در شرایط گلخانه ای رشد کردند. سمپاشی هر چهارده روز به مدت 11 ماه همراه با لقاح انجام شد. تغذیه بر اساس فرمول اشتاینر در آب اعمال شد و 1 میلی لیتر در لیتر ANIBAC 580® (آمونیوم چهارتایی) به آن اضافه شد تا از حضور عوامل بیماری زا در بستر جلوگیری شود. در هر تیمار از ده گیاه استفاده شد.
از محیط کشت موراشیگه و اسکوگ همراه با 30 گرم در لیتر ساکارز، 80 میلی گرم در لیتر آدنین سولفات، تیامین، گلیسین، پیریدوکسین، اسید نیکوتین (0.5 میلی گرم در لیتر) و اینوزیتول (100 میلی گرم در لیتر) استفاده شد. ; pH بر روی 5.7 تنظیم شد و 7.5 گرم در لیتر از Merck® آگار به عنوان عامل ژل کننده استفاده شد. همچنین از فلاسک های 100 میلی لیتری با 20 میلی لیتر محیط کشت استفاده شد. محیط کشت به مدت 18 دقیقه در اتوکلاو عمودی در 2/1 کیلوگرم سانتی‌متر مربع و دمای 120 درجه سانتی‌گراد استریل شد.
برای استقرار در شرایط آزمایشگاهی، گیاهانی که با ضدعفونی‌کننده‌ها تیمار شده و به مدت 185 روز پس از پیوند رشد کردند، استفاده شد. شاخساره های زیر بغل 3 تا 5 سانتی متری برداشته شد و بر اساس تیمار به طور جداگانه قرار گرفتند. برگها و دمبرگها از هر شاخه جدا شده و با آب و صابون فراوان شسته شدند. سپس شاخه ها به مدت 30 دقیقه در محلول تهیه شده با قارچ کش Tokat® (1 میلی لیتر L-1) و باکتری کش Agry-Gent Plus 5000 غوطه ور شدند. پس از 30 دقیقه، در شرایط آسپتیک، ریزنمونه ها به مدت 1 دقیقه در اتانول 70 درصد غوطه ور شدند، الکل خارج شد و محلول هیپوکلریت سدیم 0.16 درصد (NaOCl) به آن اضافه شد. ریزنمونه های موجود در محلول به مدت 5 دقیقه تکان داده شدند و سپس سه بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند.  در ارتفاع؛ پنج ریزنمونه در هر فلاسک کشت ایجاد شد و در دمای 2 ± 28 درجه سانتیگراد، با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور 32 میکرومول در m 2·s-1 انکوبه شدند.

شناسایی آلاینده ها

برای شناسایی آلاینده هایی که در طول ایجاد کشت فیلودندرون آسپتیک رشد کردند، یک نمونه از هر ریزنمونه آلوده با یک سوزن کالبد شکافی استریل گرفته شد. 12 جدایه قارچی و یک ایزوله باکتریایی به دست آمد. هر نمونه در پتری دیش با دکستروز آگار سیب زمینی (PDA) قرار داده شد و در دمای اتاق به مدت 72 ساعت انکوبه شد. آلاینده ها مجدداً روی PDA برای به دست آوردن کشت های خالص جداسازی شدند. میسلیوم قارچی روی اسلایدهایی با لاکتوفنول آبی سوار شد. ساختار مورفولوژیکی آلاینده با میکروسکوپ ترکیبی در 40x مشاهده شد.
ایزوله خالص که از نظر بصری به عنوان باکتری شناسایی شد، روی محیط PDA با 2 میلی لیتر در لیتر اسید لاکتیک 25 درصد و محیط کشت با ائوزین متیلن بلو (EMB) آگار تلقیح شد و به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه شد. جداسازی‌ها نیز در برش‌های سیب‌زمینی در محفظه‌های رطوبت با استفاده از حوله‌های کاغذی، آب و ظروف پتری استریل ساخته شدند. یک خراش با یک سوزن کالبد شکافی استریل شده ایجاد شد و با کشت خالص تلقیح شد.